时空简讯第26期。

哺乳动物早期胚胎发育起始于卵子和精子的融合，继而形成全能性的受精卵。但关于受精卵如何最终发育形成包括人在内的完整生物体，仍是当下生命科学领域面临的难题之一。而单细胞测序、胚胎体外重构及相关技术的出现，使得我们逐渐揭开了生命早期发育的神秘面纱。在此，本期遴选了10篇有关人、小鼠、猪等胚胎发育、体外胚胎模型建立、类器官培养，以及相关技术工具类文章，这些文章发表于顶级期刊Nature、Cell、Science及其子刊，供参考学习。

胚胎发育

Embryonic Development

scRNA-Seq全面深度揭示哺乳动物胚胎的发育路径

Nature [IF: 43.070]

① 利用sci-RNA-seq3，分析了来自妊娠第9.5~13.5天的61个不同胚胎发育时期的小鼠胚胎（雄性31个，雌性30个），获得了2,058,652个单细胞转录组，系统性地绘制了形成各种器官的细胞分化路径及每个路径中几万种基因的表达变化，对研究哺乳动物包括人类胚胎发育和器官发生具有重要意义。

② 在创建的“小鼠器官发生细胞图谱”（mouse organogenesis cell atlas, MOCA; http://atlas.gs.washington.edu/mouse-rna/）中，鉴定了超过500种细胞类型和56个发育亚轨迹，每个亚轨迹都由多个标记基因区分，并且基本上共同跨越了每个器官系统。

③ 对于Monocle3，引入了一个在相同尺度上运行的轨迹推断的计算框架，并应用该框架探索了细胞类型中基因表达的动态变化和随时间变化的轨迹，包括对顶端外胚层嵴、肢体间充质（limb mesenchyme）和骨骼肌的重点分析。（Eric_HU/Lina）

小鼠胚胎的sci-RNA-seq3分析流程示意图

The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis.

2019.02.20, DOI: 10.1038/s41586-019-0969-x

研究文章；生命发育；小鼠，胚胎，器官发生，发育，sci-RNA-seq3; Junyue Cao, Malte Spielmann, Cole Trapnel, Jay Shendure; University of Washington, Brotman Baty Institute for Precision Medicine, Howard Hughes Medical Institute; USA.

小鼠胚胎全组织、单细胞分辨率转录组的变化

Nature [IF: 42.778]

① 系统地量化了小鼠从胚胎发育的第10.5天（E10.5）到出生（P0）17个组织和器官的polyA-RNA，系统地绘制了小鼠聚腺苷化RNA转录组图谱，该图谱是由动态细胞分化、体轴和细胞增殖基因构成的全局结构。

② 利用scRNA-seq（逆转录成cDNA的测序）对组织水平的转录组进行解析，发现神经发生和造血在基因和细胞水平上都占主导地位，共同揭示了1/3分化基因的表达并确定了超过40%的细胞类型。

③ 整合启动子序列基序与ENCODE表观基因组谱，在神经元表达簇中发现了一个显著的启动子去抑制机制，该机制可归因于已知的和新的抑制因子。

④ 聚焦于发育树，通过scRNA-seq数据识别了包括祖细胞和计算推断谱系关系的分化状态在内的25种候选细胞类型。

⑤ 利用scRNA-seq分离细胞类型的转录因子网络和候选增强子元件的互补集，解析了整合来自全组织表观基因组染色质数据中的顺式元件（IDEAS）模型。（吕玉琦/Lina）

小鼠胚胎全组织polyA-RNA转录组结构

The changing mouse embryo transcriptome at whole tissue and single-cell resolution.

2020.07.29, DOI: 10.1038/s41586-020-2536-x

研究文章；生命发育；小鼠，胚胎，转录组，polyA-RNA, scRNA-seq; Peng He, Brian A. Williams, Barbara J. Wold; California Institute of Technology; USA.

跨物种单细胞转录组分析揭示猪、猴子和人类之间原肠胚前期的发育差异

Cell Discovery [IF: 10.849]

① 猪原肠胚前期4个胚胎阶段：早期囊胚（E5~6）、晚期囊胚（E7~8）、球形胚胎（E10~11）、丝状胚胎（E12~13），共分离出301个单细胞，通过scRNA-seq检测到13,227个基因，构建了一个完整的猪胚胎发育早期（着床前）的单细胞全景，并跨物种比较揭示了种间差异，这有助于开发有效策略来克服人-猪低嵌合现象，从而在猪体内产生有功能活性的人体器官。

② 跨物种比较猪、人和猴子不同发育阶段的外胚层（epiblast，EPI）转录组，揭示了参与早期、晚期EPI转换的许多通路的差异，确定了猪、人类和猴子之间多能性谱的发育坐标。

③ 多能性相关的代谢、表观遗传和转录调控跨物种比较，发现在猪、人和猴子的EPIs中，氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解相关基因的表达模式总体上相似，并在EPI发育过程中鉴定了一些物种特异性的表观遗传调控因子和TFs/辅助因子。

④ EPIs膜相关基因跨物种比较，揭示了猪和人/猴EPIs之间与表面受体、细胞粘附和细胞通讯相关基因表达模式的差异，这些差异可能会阻碍供体人/猴细胞与宿主猪胚胎细胞之间的正确识别和通信，导致供体细胞在跨物种嵌合体中的整合和存活率较低。

⑤ 不同发育阶段（Pre-TE和Post-TE）的TE谱系（TE lineages），如钙粘蛋白和猪胚胎伸长等相关基因转录组跨物种比较，发现人类与猴子Post-TEs更相似，进一步分析发现，与人/猴子相比，猪胚胎在着床前发育阶段中的伸长（elongation）具有轴突伸长的部分分子特征。（杨博林）

用于scRNA-seq分析的猪胚胎组织

Cross-species single-cell transcriptomic analysis reveals pre-gastrulation developmental differences among pigs, monkeys, and humans.

2021.02.02, DOI: 10.1038/s41421-020-00238-x

研究文章；生命发育，生命进化；人，猪，猴子，胚胎，原肠胚，scRNA-seq; Tianbin Liu, Jie Li, Leqian Yu, Jun Wu, Ying Gu；中国科学院大学华大教育中心，深圳华大生命科学研究院；中国

拟胚胎模型

In Vitro Embryonic Model

单细胞和空间转录组揭示类原肠胚中的体节发生

Nature [IF: 42.778]

① 对120 h时间点的100个类原肠胚scRNA-seq分析，获得25,202个细胞（13种细胞类型），并与E8.5小鼠胚胎scRNA-seq数据集比较，同时结合空间转录组（tomo-seq，RNA断层扫描）分析E8.5小鼠胚胎，表征了小鼠类原肠胚与胚胎中胚层之间的相似性，确认类原肠胚可以作为对胚胎发育过程进行研究的良好体外模型。

② 在小鼠胚胎发育过程中，神经分化和中胚层分化具有很强的空间分布特点：神经中胚层祖细胞位于尾芽部位（较后侧），而分化的组织位于更前侧的位置。

③ 对类原肠胚沿着前侧到后侧轴进行冷冻切片，应用tomo-seq分析发现，类原肠胚中各种细胞的位置与在胚胎体内分布的空间位置是比较一致的；与E8.5小鼠胚胎进一步对比分析，发现两者中调节体节生成的基因表达是非常相似的。

④ Notch报告基因活体成像检测及Notch信号抑制等实验，发现类原肠胚中报告基因的表达与在小鼠胚胎中类似，同样也依赖于Notch信号通路的活性；体节时钟（somitogenesis clock）的动态活性变化与体内发育过程非常相似。（邵利彬/董方圆）

注：体节形成过程中主要受Notch、FGF和WNT信号通路调节，其中Notch信号在分节时钟和体节边界形成中均起重要作用。

小鼠类原肠胚的scRNA-seq和tomo-seq分析及与小鼠胚胎的比较

Single-cell and spatial transcriptomics reveal somitogenesis in gastruloids.

2020.02.19, DOI: 10.1038/s41586-020-2024-3

研究文章；生命发育，生命机理；小鼠，胚胎，类原肠胚，发育，scRNA-seq, tomo-seq; Susanne C. van den Brink, Anna Alemany, Vincent van Batenburg, Alexander van Oudenaarden; Oncode Institute, Hubrecht Institute-KNAW, University Medical Center Utrecht; The Netherlands.

首个由人类胚胎干细胞建立的体外人类胚胎3D模型

Nature [IF: 42.778]

① 展示了人类胚胎干细胞可用于生成类原肠胚，即三维多细胞聚集体，其可分化形成时空组织的三个胚层的衍生物，且无需其他胚胎外组织，为揭示和研究人类胚胎发育早期特异性调节过程提供了一个实验性的、可操控性的模型系统。

② 自然产生的人类原肠胚会产生前后极性，在Chiron（WNT激动剂）的存在下，培养的类原肠胚也会沿前后轴延伸，并沿着该轴启动了与正常胚胎一样的特定模式的基因表达。

③ 通过报告系统（RUES2-GLR13）来识别表达中胚层（BRA）、内胚层（SOX17）和神经外胚层（SOX2）标记基因的细胞，追踪到类原肠胚产生三胚层衍生物的过程。此外，进一步发现，Nodal和WNT信号通路之间的平衡在决定细胞命运和促进人源类原肠胚延伸方面发挥了一定的作用。

④ 应用tomo-seq（一种应用于全胚胎和解剖器官的空间转录组测序方法）分析经Chiron预处理72 h的类原肠胚，鉴定出1,023个基因，这些基因被分为22类代表所有三个胚层的主要表达模式。

⑤ 通过体细胞发生的特征，表明培养了72 h的人类原肠胚表现出卡内基分期（Carneigie stage）第9期胚胎（约19~21 d）的一些关键特征。（榆树）

Chiron预处理及体外人源类原肠胚形态变化

An in vitro model of early anteroposterior organization during human development.

2020.06.11, DOI: 10.1038/s41586-020-2383-9

研究文章；生命结构，生命发育；人，胚胎干细胞，原肠胚，胚胎模型，基因表达，tomo-seq; Naomi Moris, Kerim Anlas, Alexander van Oudenaarden, Alfonso Martinez Arias; University of Cambridge, Oncode Institute, Hubrecht Institute-KNAW (Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences) and University Medical Center Utrecht; UK, The Netherlands.

类器官再生

Organoid Regeneration

前肠器官发生过程中协调内胚层和中胚层多样化的信号网络

Nature Communications [IF: 12.121]

① 应用scRNA-seq，对来自三个关键发育时间点（E8.5、E9.0、E9.5）的小鼠胚胎前肠进行分析，共获得31,268个细胞，鉴定出24个细胞簇并将其分为了9种主要细胞系：内胚层（endoderm，DE）、脏壁中胚层（surrounding splanchnic mesoderm，SM）、生心中胚层（cardiac）、其他中胚层（躯体和近轴）、内胚层、血液、外胚层、神经胚和胚外（胎膜），构建了胚胎小鼠前肠的高分辨率细胞状态图（https://research.cchmc.org/ZornLab-singlecell）。

② 进一步分析，鉴定了与器官特异性上皮紧密结合发展的SM细胞类型的多样性，13个主要SM组由36个阶段特异性亚群组成（E8.5，7个亚群；E9.0，12个亚群；E9.5，17个亚群）。

③ 通过将旁分泌信号通路的转录谱投射到这些谱系上，定义了一个协调前肠器官发生的内胚层-中胚层相互作用的复杂时空信号网络。

④ 通过小鼠遗传学验证了关键预测，显示了内胚层来源的信号在中胚层模式中的重要性。并利用这些信号的相互作用，从人类多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSC）生成了之前难以获得的多种SM亚型。（宓晓晴）

小鼠前肠内胚层和中胚层谱系的scRNA-seq分析

Single cell transcriptomics identifies a signaling network coordinating endoderm and mesoderm diversification during foregut organogenesis.

2020.08.27, DOI: 10.1038/s41467-020-17968-x

研究文章；生命结构，生命发育；小鼠，胚胎，前肠，人多能干细胞，器官发生，scRNA-seq；Lu Han, Praneet Chaturvedi, Keishi Kishimoto, Aaron M Zorn. Cincinnati Children s Hospital, USA.

时空技术

Spatial-Temporal Technology

sci-Space构建小鼠胚胎单细胞空间转录组图谱

Science [IF: 49.962]

① 提出了一种将单细胞基因表达差异与空间背景结合起来的新方法——sci-Space，该方法能够在保留单细胞分辨率的同时在更大的尺度上解决了空间异质性。

② 应用sci-Space对来自2个发育第14天的小鼠胚胎的14个矢状面切片进行了分析，绘制出121,909个细胞核的基因表达图谱和近似空间坐标，证明了sci-Space可以显示转录组中的任何基因，类似于原位杂交。

③ 通过分析图谱，鉴定出数千个基因呈现出与解剖结构有关的表达模式，在分析的细胞类型中结缔组织祖细胞和神经元的空间自相关基因最多，每个细胞中分别平均有12,150±2,270、8,623±3,846个基因，表明sci-Space能够区分由单个细胞类型驱动的基因表达空间模式，以及跨多个细胞类型的基因表达空间模式。

④ 利用空间信息对各种类型的细胞进行亚型注释，揭示了细胞类型在空间模式化程度方面存在很大差异，表明这些细胞亚型在体内以位置依赖的方式行事；采用拟时序分析，得出神经胶质细胞、辐射状细胞和神经元三种脑细胞随时间进行分化和迁移。（WRQ/Lina）

小鼠胚胎组织的sci-Space分析流程示意图

Embryo-scale, single-cell spatial transcriptomics.

2021.07.02, DOI: 10.1126/science.abb9536

研究文章；时空技术；小鼠，胚胎，空间标记，基因表达，sci-Space; Sanjay R. Srivatsan, Mary C. Regier, Jay Shendure, Kelly R. Stevens, Cole Trapnell; University of Washington, Institute for Stem Cell Regenerative Medicine, Brotman Baty Institute for Precision Medicine; USA.

DBiT-seq揭示小鼠胚胎多组学高分辨率图谱

Cell [IF: 38.637]

① 开发了一种全新的高分辨率（10 μm）空间组学测序技术DBiT-seq（Deterministic Barcoding in Tissue for spatial omics sequencing），该方法利用微流控技术来实现组织切片的空间组学测序（转录组和蛋白组）。DBiT-seq主要基于两次的编码来实现细胞空间位置的定位：第一次编码通过细胞内逆转录RNA成cDNA来实现；第二次编码则是通过DNA连接酶来实现。

② 将DBiT-seq应用于50 μm像素大小的小鼠胚胎（E10）组织切片中，构建了空间多组学图谱，每个切片共检测到mRNAs相关的12,314个UMIs和22种蛋白质的3,038个UMIs，揭示了Notch信号在调节小鼠胚胎发育过程中的重要作用。

③ 采用更高分辨率（像素大小=25 μm）的DBiT-seq分析E10小鼠胚胎组织样本的大脑区域，Pan-mRNA和Pan-protein空间表达图均显示出可分辨的脑部精细结构，如脑微血管网络和光学囊泡内的单细胞层黑素细胞，且与免疫荧光染色图像及H E染色图像能够很好地重叠在一起，证明了DBiT-seq的精确性。

④ 利用10 μm微流控通道对E.10小鼠胚胎脑区进行DBiT-seq检测，描述了眼睛早期发育的空间单细胞转录图谱，证实DBiT-seq能实现全基因组表达的高空间分辨率可视化。

⑤DBiT-seq技术可被无微流体学经验的研究人员所采用，并可能应用在发育生物学、癌症生物学、神经科学和临床病理学等领域。（黄玉芬）

DBiT-seq工作流程图

High-spatial-resolution multi-omics atlas sequencing of mouse embryos via deterministic. barcoding in tissue.

2020.11.13, DOI: 10.1016/j.cell.2020.10.026

研究文章；时空技术；小鼠，胚胎，大脑，DBiT-seq；Yang Liu, Mingyu Yang, Yanxiang Deng, Rong Fan; Yale University, Yale School of Medicine; USA.

基于光隔离化学的高深度空间转录组分析

Nature Communications [IF: 14.919]

① 建立了一种针对高空间分辨率的转录组图谱分析技术——光隔离化学（photo-isolation chemistry，PIC），该方法使用光笼式寡脱氧核苷酸（caged ODNs）进行原位逆转录，允许从感兴趣的光照射区域确定表达谱。

② PIC转录组分析检测小鼠胚胎组织中小的不同区域中特异性表达基因，证明了PIC可以为小鼠胚胎组织中几十个小区域的细胞提供详细的基因表达谱；单细胞的光辐照显示，用7×104个独特的读计数检测到约8,000个基因。

③ PIC转录组分析适用于复杂精细结构中的细胞、组织学上分散的细胞，以及亚细胞、亚核微结构（应激颗粒和核散斑），可以从有限区域到亚细胞和亚核分辨率来确定高深度的转录组图谱，以精细的空间分辨率解剖出细胞的详细特征。（LR）

应用PIC进行基因表达谱分析的示意图

High-depth spatial transcriptome analysis by photo-isolation chemistry.

2021.07.20, DOI: 10.1038/s41467-021-24691-8

研究文章；时空技术；小鼠，胚胎，基因表达，PIC，RT-PCR，空间，转录组学；Mizuki Honda, Shinya Oki, Yasuyuki Ohkawa; Kyushu University, Kyoto University Graduate School of Medicine; Japan.

生信工具

Bioinformatics Tools

单细胞转录多样性是发育潜能的标志

Science [IF: 47.728]

① 证实了一个简单而精确的发育潜能决定因素：每个细胞表达基因的数量，并利用这种转录多样性的测量方法开发了一个计算框架——CytoTRACE（https://cytotrace.stanford.edu/），可用于利用scRNA-seq数据预测分化状态，这对识别整个多细胞生命中复杂组织中未成熟细胞的发育轨迹具有重要意义。

② 应用于跨组织、物种和平台[141,267个单细胞，涵盖266个表型，9个生物系统，5个物种（包括2个完整生物）和9个scRNA-seq平台（3个基于液滴和6个基于板的平台）协议]时，发现CytoTRACE的性能优于先前的方法（如基因计数、GCS等），可以解析将近19,000个带注释的基因集，从而解析52个实验确定的发育轨迹。

③ 探索了CytoTRACE在识别健康组织和人类癌症中与干细胞和分化相关的关键基因方面的实用性。例如，通过将RNA含量与CytoTRACE结合，首次证明使用无监督的计算机方法可以将静止的成年干细胞与下游祖细胞区分开来；使用细胞追踪分析人类乳腺肿瘤的scRNA-seq谱，发现了与分化程度较低的管腔祖细胞相关的新候选基因，并确立了GULP1在乳腺肿瘤发生中的新作用。（王美琪/Lina）

CytoTRACE方法的建立

Single-cell transcriptional diversity is a hallmark of developmental potential.

2020.01.24, DOI: 10.1126/science.aax0249

研究文章；生信工具；小鼠，人，胚胎，发育生物学，细胞分化，CytoTRACE, snRNA-seq; Gunsagar S Gulati, Shaheen S Sikandar, Aaron M. Newman; institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University; USA.

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